合成生物学可以渗透到农业虫害防治的各个方面,从抗虫作物及昆虫天敌的基因水平培育；从植物来源到微生物来源的抗虫天然化合物的异源表达及产物结构优化和创新；从RNA干扰技术到昆虫信息素的在杀虫领域的应用,等等,在虫害管理的各个方面都可以通过合成生物学的应用得到质的提高。
1. RNA干扰技术在杀虫剂上的应用
RNA干扰(RNA interference, 以下简称RNAi)的机制由科学家 Andrew Fire 和 Craig Mello在1998年发现,并于2006年获诺贝尔生理学或医学奖。生物的遗传密码存在于DNA,DNA通过转录合成RNA,RNA翻译成蛋白质,不同的蛋白质则在生物体内表现出不同的生物功能,赋予生物的生命活性。RNAi技术首先在医学上得到应用,该技术可以破坏目标基因的RNA产物使其失去合成特定蛋白质的能力,所以是一种暂时性的治疗而不会影响作为遗传物质的DNA。RNAi技术在农业害虫防治领域的应用是一项革命性的创新,完全不同于传统的防控途径,主要因为RNAi产品与化学农药的作用方式有着本质上区别。 许多化学农药的作用机制是通过药物小分子与害虫体内与生命相关的某种蛋白质的结合,使蛋白质失去生物功能,从而影响到害虫的某种生理机能来达到致死作用,而RNAi则是破坏用以合成这种目标蛋白质的信使RNA,使蛋白质的生物合成受到抑制。
作为遗传物质DNA转录产物的RNA有两大特点,首先是基因序列的特异性,这种特异性导致了大自然生物的多样性,RNA的另一个特点是其不稳定性,容易受到大自然无处不在的RNA酶的破坏,上述两大特征体现到作为杀虫剂使用时则表现为药物的特异性,高效性以及无残留。RNAi是在不改变DNA遗传特性的前提下对基因功能的改变,因此RNAi可以达到基因修饰相似的结果,而且比DNA修饰具有更大的优势,在适当设计的基础上,RNAi可以通过一个转移子同时修饰多个基因,使目标生物同时获得多种性状的改变,这种优势在RNAi虫害防治方面可表现为多靶点同时作用,所产生的效果就是防治效率高,害虫不易产生耐药性。
RNAi产品的研发首先是确定需要抑制的害虫目标基因,随着DNA测序技术的发展,越来越多的生物基因组序列被测定,DNA数据库中有关农业害虫的基因组数据越加丰富,这就为RNAi技术在杀虫领域的应用提供了丰富的基因候选资源。然而,只有在合成生物学水平上对目标害虫的生命代谢途径及其生活习性有了很好的了解,才能对候选基因做出正确筛选,达到高效安全的初衷。在目前的应用实列中大多是选择害虫体内那些与生命直接相关的初级代谢的基因,由于不同生物物种之间的初级代谢基因的相似度比较高,目标基因的选择还要考虑避免可能产生的目标脱靶现象。另外目标基因也可以选择影响害虫自身保护或与抗药性相关的基因,RNAi通过抑制害虫体内该种抗性物质的产生,从而达到重获敏感性。
害虫目标基因确定之后的下一步是如何获得RNAi产品以及保持RNA的稳定性。在RNAi的产生机制中,首先是由双链RNA诱导(dsRNA或shRNA),然后由内切酶将dsRNA水解成较短的单链RNA(siRNA) ,siRNA与目标RNA结合后体系最终将双链的目标RNA破坏。所以,双链的dsRNA或发夹RNA(shRNA)以及单链的siRNA均可作为RNA干扰杀虫剂应用,其生产方式方法也相应不同,包括植物合成、微生物发酵、化学合成及无细胞生物合成等。
植物合成法即将确定的害虫目标基因序列转入到载体作物中,由作物来合成害虫目标基因的dsRNA,也即形成了抗虫作物,但这种作物不是用于人或动物,而是做成制剂用于杀虫。2017年, 美国孟山都利用RNAi技术研发的能够抗玉米根虫的转基因玉米获得美国环境保护局的批准作为抗玉米根虫病的杀虫剂使用。这是以植物为载体生产外源RNAi杀虫剂的一个先例。
化学合成RNAi产品的一个主要缺点是生产成本高,这也是以前限制RNAi在农业上应用的一个主要障碍,但是现在化学合成的成本已经大大降低,而且化学合成法可以合成较短的siRNA(22-24 nt),相比dsRNA(大于500 bp)而言要经济的多。
无细胞生物合成是合成生物学在dsRNA合成上的首先应用,这种方法是利用依赖于DNA的RNA合成酶来进行,并且使合成的成本大幅度降低。在2008年化学合成dsRNA的成本为12500美元/克,到2016年的无细胞生物合成则降为100美元/克,目前已经降到低于60美元/克。美国初创企业GreenLight Biosciences的GreenWorX?技术既是基于这个原理,这种合成方法的优势在于可以相对低的成本合成出高质量的RNA产品,据报道其dsRNA的生产成本已经可以降到0.5美元/克。
微生物发酵法是选择一种安全无害的微生物菌种作为载体,如酵母菌、大肠杆菌或苏云金芽孢杆菌等其他微生物,将目标基因克隆到作为载体使用的微生物中,通过发酵使微生物菌体细胞产生目标基因的dsRNA。由于所产生的dsRNA存在于微生物菌体细胞内,稳定性相对提高。微生物发酵法是目前发展最好的dsRNA生产方法,多家公司已经转向这个途径,其中RNAgri利用微生物发酵法已经可以使dsRNA的生产成本降到1美元/克,而且他们利用一种特殊的发酵工艺将一种蛋白质结合到所产生的dsRNA分子上可以防止其降解。利用微生物发酵技术开发RNAi产品的公司还包括Renaissance BioScience和RNAissance Ag等。Renaissance BioScience于2019年5月获得dsRNA的生产和使用方法专利。目前以微生物为载体的dsRNA生产中大多以酵母菌株作为载体,实际上也可以使用具有其它生物活性的放线菌或霉菌等作为载体,以便通过某些途径取得双重或增倍的药效,当然这些微生物较酵母和大肠杆菌这样的模式菌而言在基因改造和细胞培养上的复杂性将会增加。
总的来说,RNAi抗虫产品将会是抗虫剂研发领域的一个重要方向,利用合成生物学理念对目标基因的选择以及通过合成生物学手段对生产菌株加以设计和改造,从而使RNAi产物的产率得到大幅度提升将是在竞争中取胜的根本要素。在目前基因库中巨量的基因组信息以及蛋白质立体结构信息的前提下,人工智能(AI)技术在早期目标基因的高通量筛选以及效果模拟中也将是今后研发竞争力的重要要素之一。值得指出的是,RNAi产品不仅可以应用于害虫防治,只要设计出合适的用于抑制的目标基因,其RNAi产物也可以用于抗细菌,抗真菌甚至抗病毒和杂草等其它多个方面。
2. 通过微生物异源合成植物源农药
植物会产生很多物质,主要是次级代谢产物,用来抵御病虫侵害,这些抗性物质就是植物源杀虫剂的来源。有报道指生物源农药在2014年占全球农药市场的 4-5%,到2022年的占比增加到10%,预计到2025 年这个占比率将达到20%。植物源农药是生物源农药的重要组成部分,据报道自然界中有超过 80% 的已知天然化合物能够由植物产生,而迄今为止在植物中发现的天然化合物已经超过 20万种,因此有理由相信在植物中还有近 100 万种新化合物有待发现。尽管如此,到目前为止开发成为杀虫剂的产品少之又少,实际上到目前只有不到1%的植物次级代谢产物进行过抗虫活性测试。
开发植物源生物活性物质所面临的主要问题是这些次级代谢产物在植物中的含量都很低,需要进行提取浓缩,并加以纯化才能发挥作用,而且大部分植物来源还受到资源限制。在合成生物学时代,开发植物源天然化合物的一个理想途径是将微生物作为载体来生产目标化合物,即首先了解和设计出目标化合物的生物合成途径,然后将合成途径中所需要的所有合成基因克隆到载体微生物中,通过微生物发酵来获得目标化合物。这个目标的实现需要解决生物合成途径的设计,表达,以及产率提高等一系列问题。
首先是目标化合物的生物合成途径的了解和设计,许多较简单的天然化合物的生物合成途径已经得到较好的研究,可以直接进行异源表达的设计,但更多的化合物尤其是拥有复杂结构的化合物的生物合成途径则是未知的,在植物中研究化合物的生物合成途径比较困难,因此筛选产生目标化合物的共生微生物是另外一种途径,以期从微生物中找到目标化合物的生物合成基因簇并进行基因克隆。然而在合成生物学领域目前比较前沿的方法则是通过人工智能(AI)和机器学习来进行目标化合物生物合成途径的设计,这种方法可以实现目标化合物生物合成途径的优化,从而实现天然化合物的人工制造以及人工智造。
其次需要考虑的是微生物生物合成平台的建立,目前天然产物的异源表达主要是利用大肠杆菌和酵母这2种模式微生物。目前的工作主要局限于这两种模式微生物作为载体,是因为目前大多数研究者的操作技术只能做模式菌,但霉菌理论上讲具有更大优势,而且霉菌比酵母具有更完善的次级代谢体系。
用于天然化合物异源表达的微生物平台还有多种途径可以进行合成生物学范畴的优化,以便提高目标化合物表达产率,比如提高前体化合物的供应量,减少前体浪费(消除旁路代谢),提高氧化还原反应代谢平衡水平,提高碳源利用率等。
提高微生物异源表达平台合成效率的实列之一是研究人员将乙酰辅酶A(一种植物天然产物生物合成的前体)生物合成途径中的4个合成基因克隆到酵母内,使该酵母合成类异戊二烯金合欢烯的产率提高了25%以上,从而提高植物天然合成产物的效率。另外,研究人员通过增加抗反馈抑制的酶,对反应途径限制性步骤的酶进行超表达,以及敲除与合成反应存在竞争的反应途径的酶等方法,可以使作为许多植物化合物前体的4-香豆酸的产率达到了1.9克/升发酵液。
3. 通过植物合成昆虫信息素和其它生物农药
前面提到过利用转基因玉米生产抗虫dsRNA, 实际上,以植物为载体还可以合成许多其它异源化学物质和生物农药。例如,ISCA, Inc. 一家位于加利福尼亚州的绿色农业科技公司, 该公司的研究人员与瑞典研究团队(隆德大学、瑞典农业大学等研究人员)通过植物转基因技术成功的使亚麻荠植物合成出昆虫性信息素前体,为害虫防治的绿色化提供了一种低成本的信息素来源。
利用植物为载体来生产dsRNA干扰物质和昆虫信息素等为生产绿色杀虫剂提供了新的途径,但是仍然有其不足之处,植物的生长需要大片土地并消耗大量水资源,解决这个问题的途径之一是在上节中讨论的微生物异源表达途径,另一个有前途的发展途径即为植物细胞培养技术,利用植物细胞培养技术可以将上述提及的生物合成在生物反应器中进行。Calyxt就是这样一家应用合成生物学技术通过植物细胞培养来生产天然化合物的公司。Calyxt认为植物细胞具有产生天然化合物的独特能力,并且是生产这些化合物的更好系统,因为植物是这些化合物中大部分的天然生产者。从这个角度出发,与利用微生物生产天然化合物相比,植物细胞可以利用自身的生物合成机制直接合成,而无需像微生物体系那样需要设计和建立新的复杂异源生物合成途径与基因体系。实际上,以植物细胞培养来生产异源的天然化合物还具有其它一些优势,比如植物细胞培养是利用二氧化碳的过程,对于环境保护减少碳排放具有重要意义。
4. 合成生物学在生物防治领域的应用
生物防治是利用自然界生物平衡力量达到防治病虫害的目的,也即利用天敌来对害虫进行防治,至今已经有数百年的广泛应用历史,也被认为是减少化学农药大规模使用的最佳替代途径。过去,人们通常通过在世界范围寻找更有效的可以用作生物防治剂的野生天敌或菌株来提高生物防治的效果。然而,2014年10月生效的《〈生物多样性公约〉关于获取遗传资源和公正公平分享其利用所产生惠益的名古屋议定书》对生物材料的国际间交换做出了非常严格的限制,除此之外,有些地区对生物防治剂的使用也有着自己的严格限制,比如只允许使用当地的天敌和菌株。由此一来,通过寻找野生天敌和菌株来获得更有效的生物防治剂的传统途径受到了极大制约。然而,在有机食品生产市场增长的推动下,对更有效的生物防治剂的需求却在急剧上升。全球有机食品市场在2013已经达到629 亿美元,生物防治剂的销售额增长速度是农药的三倍,全球生物防治市场在2015年已达到17 亿美元。此外,环境保护和绿色农业发展的政策也旨在减少合成杀虫剂的使用,例如欧盟范围内的新烟碱类禁令以及美国和世界范围内逐步减少有机磷酸盐的使用。随着有机食品市场兴起以及农药使用减少无疑将促进生物防治领域的快速发展以及其市场价值的增加。目前在生物防治剂方面面临的迫切问题就是如何能够立足于本土资源,快速的提高已有本土生物防治剂的有效性,以及开发新的本土生物防治剂,这些目标的实现必须依赖于现代合成生物学在该领域的应用。
基因工程技术已经在作物和动物育种上得到了有效应用,但是在生物防治剂方面却很少获得应用,这使得合成生物学技术在生物防治技术的创新提高上有着更大的发展空间。随着基因工程技术的发展以及DNA测序的普及,对作为生物防治剂使用的害虫天敌或者微生物菌株的基因组测序也变得越加容易,为通过信息生物学和合成生物学研究鉴定出与所需生物性状相关的基因提供了条件,这样就可以利用基因沉默(RNAi)或基因消除(如CRISPR)技术对所需的生物性状进行改进,使目标生物防治剂对害虫产生更有效的生物防治效能。这些生物防治剂需要优化的性状方面包括对害虫的抑制能力,对环境及非生物因子的适应能力,对生态危害性的降低,以及这些生物防治剂在工业化产量提升和储存方面性能的提升等。
合成生物学在生物防治剂人工选育上同样可以发挥作用,生物防治剂的人工筛选通常需考虑几个因素,作为生物防治剂使用的生物对气候环境的耐受性(可以扩大使用地域范围),对杀虫剂的抗性(可以和杀虫剂同时使用),对作物的适应性,以及其自身的繁育速度等。传统的选育方法是通过表观性状进行筛选,面临很多困难和问题,比如所需生物性状的持续保持和传代等问题以及某些性状之间的平衡问题等,通过对这些生物性状在基因水平上的了解,从而通过基因型来进行人工筛选则可以使这些问题得到解决,使生物防治剂的物种和菌株筛选更加便捷,清晰和可控。例如在基因水平上对所要筛选的性状基因上加入标记就可以通过基因标记在基因水平上进行生物性状筛选。用于基因筛选的基因标记还可以用来作为环境监测的信号,用以检测环境的基因多样性,生物防治剂的效果表现,以及对生态的危害性等。
利用合成生物学手段对生物防治剂的改造只涉及作为生物防治剂使用的天敌或菌株本身的基因改造,而且可以无需引入外源基因,因此其应该是符合有机食品工业的要求以及 GMO的管理要求。然而由于世界上对转基因产品规定的不同,以及人们对基因改造的生物防治剂的接受程度,生物技术在生物防治剂领域的应用目前还应谨慎对待。
5. 合成生物学在开发微生物源生物杀虫剂上的应用
自1950年起,苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称BT)一直主导着生物杀虫剂市场,在北美的农作物和森林中有75%通过使用BT细菌来控制虫害。1980年代陆续发现了Colletotrichum gloeosporioides(Penz.) Sacc. f. sp.Aeschynomenes,Phytophthora palmivoraButler和C.gloeosporioidesf. sp.Malvae等菌株并先后被开发成为生物杀虫剂产品,1990年代又将Streptomyces griseoviridis开发成首个生物抗真菌产品。
生物农药在全球范围的使用每年稳定增长10%,但生物杀虫剂产品只占世界杀虫剂市场的1.5%,而且主要是BT类产品,具有很大的发展空间。目前许多BT菌株已经被进行完整DNA测序,利用信息生物学方法可以找到很多抗虫蛋白或多肽的生物合成基因,对抗虫蛋白的作用机理也愈加了解,近期AlphaFold 宣布经人工智能解析的蛋白结构数据库已经超过2亿个,也即几乎所有已知蛋白基因序列都可以通过AI解析出其蛋白立体结构。这些丰富的BT基因序列以及其蛋白立体结构数据,将使得利用合成生物学改造和提高已有BT蛋白活性,发现新的抗虫蛋白变得更加容易,甚至可以结合机器学习来设计和合成全新的抗虫蛋白或多肽产品。
除苏云金芽孢杆菌外某些病毒也显示出杀虫活性并被开发成生物杀虫剂,比如杆状病毒科(Baculoviridae)就被看好具有作为生物杀虫剂的开发前景。目前世界上已经有数种杆状病毒被注册为生物杀虫剂产品,而且其中不乏成功的用于控制农业鳞翅目害虫的生物杀虫剂产品。杆状病毒的DNA是一个大小为70-170kb的环状结构,含有37个高度保守的核心基因,其宿主局限于节肢动物尤其是害虫,因此是一类安全的生物杀虫剂。由于其作用方式不同于苏云金杆菌,杆状病毒杀虫的速度不如后者快,但是杆状病毒的作用更持久,而且在害虫中更容易广泛传播。研究人员对杆状病毒的基因功能和杀虫机制都进行了大量研究,例如发现如果将病毒中的蜕皮激素UDP-葡萄糖基转移酶(EGT)基因消除后,病毒杀死害虫的速度提高了30%,对这些生物合成和杀虫机制的了解为利用合成生物学手段制造高效的新型杆状病毒生物杀虫剂提供了可能途径。
6. 作为杀虫剂的微生物次级代谢产物
与植物类似,微生物也会产生很多次级代谢产物,即小分子的天然化合物,而且这些化合物是抗生素等药物的主要来源。在微生物来源的天然化合物中有许多化合物具有抗虫活性。微生物产生的抗生素主要用于医用,考虑到作用对象耐药性的产生等问题,抗生素在使用上受到严格限制,在农业上的开发应用就更少。多杀菌素是农用抗虫抗生素的一个优秀例子,它是美国陶氏益农公司开发生产的一种由刺糖多孢菌产生广谱高效的杀虫抗生素,并在国内得到广泛应用。此后,该公司又推出了新一代产品乙基多杀菌素,其抗虫效力较多杀菌素提高了10倍。在多杀菌素的研发过程中,无论是发酵产率的大幅度提高,各种类似化合物的生物合成,以及乙基多杀菌素的成功问世,都是在对其生物合成途径的充分了解的前提和指导下所实现,合成生物学技术的发展仍将会在该类生物杀虫剂以及其它微生物次级代谢产物类杀虫剂的研发方面发挥决定性的作用。
目前从微生物中发现新的有效药物(包括农药),或者利用微生物为载体平台异源表达生物活性物质是合成生物学应用的最重要领域。除已经被发现或尚未被发现的那些天然产生的化合物外,微生物中还存在大量自然条件下不能被产生的″非″天然化合物。有结果显示从微生物中分离到的化合物的数量要远远少于通过信息生物学分析到的化合物生物合成基因簇的数量,随着对大量微生物基因组的测序,人们可以利用信息生物学找出微生物中次级代谢产物的生物合成基因簇。通过合成生物学手段对那些未被表达的″沉默″基因簇的激活,将会释放除自然界的大量潜能,成为未来发现新的天然化合物的重要途径之一,这些非天然的天然化合物当然也是进行生物杀虫剂筛选的重要化合物来源。
7. 结语
综上所述,目前受到极大重视的合成生物学贯穿于杀虫剂研发的各个领域,它是由化学农药向生物农药转化不可或缺的新技术和新的杀虫剂设计方式,利用合成生物学技术不仅可以开发大量生物来源的杀虫剂,同时也可以将现有的化学合成杀虫剂转向生物合成方法制造,包括微生物、植物、植物细胞、或者无细胞生物等生物合成平台,使化学农药向绿色化发展。
传统上生物农药通常来源于植物和微生物,然而在合成生物学时代,得益于上述生物合成平台中异源表达体系的建立,人们的目光也在关注其它生物来源的活性物质,比如在蜘蛛(Vestaron Corporation中发现了具有杀虫活性但是对人和蜜蜂安全的多肽化合物,在将这种多肽的生物合成基因克隆到酵母菌后,即可以利用酵母为载体生产具有抗虫活性的多肽生物杀虫剂)、蝎子或其它生物体中寻找具有抗虫活性的多肽或其它化合物,然后同样用所建立的生物合成平台进行异源表达和生产,所有这些方法使合成生物学在现代害虫的防治领域显现着无尽的发展空间。