基因干扰(RNAi)是一种在动物、植物和微生物中高度保守的基因表达调控工具。1998年,Fire等首次在秀丽隐杆线虫中证明了触发基因沉默的关键因子是双链RNA(dsRNA),而非单链RNA。具体而言,dsRNA被Dicer-like蛋白随机剪切成长度为21～24nt的小RNA(siRNA或 miRNA),siRNA与Argonaute蛋白(AGOs)结合形成RNA诱导的沉默复合体(RISCs),该复合体与目标RNA链互补,诱导mRNA降解或抑制翻译进程。利用RNAi技术靶向有害生物的必须基因,实现高效的基因沉默,可有效控制病虫害的发生。基于RNAi技术创制的新型核酸农药被称为农药史上第三次革命,与传统化学农药相比,具有靶向性高、易降解、靶点丰富及可灵活设计等优势。

目前,RNAi在植物病虫害防控领域的应用主要通过4种途径实现：

(1)HIGS,即培育表达dsRNA的转基因植物以防治病虫害；

(2)VIGS,即利用病毒或微生物表达和递送靶标生物dsRNA的方法；

(3)SIGS,即创制喷洒型RNA农药,直接喷施于植物表面以控制病原菌和害虫；

(4)NDGS,即利用纳米载体递送dsRNA以诱导靶标基因沉默的方法。

本文介绍了以RNAi为核心的病虫害防治技术的研究现状,分别论述了基于HIGS、VIGS、SIGS和NDGS 策略的RNAi技术用于防治植物病虫害的应用实例及商业化情况,并对核转基因技术培育转基因作物和创制喷洒型RNA农药的瓶颈问题进行总结,点明了叶绿体介导的RNAi技术和纳米载体递送dsRNA策略的优势。dsRNA的合成成本、保护剂和载体制备工艺、转基因植物和载体的生物安全性评估,仍然是未来在研发和商业化生产中需要关注的问题。

2 利用HIGS策略防控病虫害

2.1 核转基因技术的应用

研究人员已成功实现利用转基因植物表达调控病虫害生长发育关键基因dsRNA,降低靶基因的表达量,导致靶标生物死亡或发育畸形,从而控制病虫害发展的策略。通过核转基因工程向细胞核导入外源基因的核基因转化技术是一种主要的HIGS策略。

2.2 基于核转基因技术培育转基因作物的瓶颈

虽然核转基因技术在防治病虫害领域取得了显著成果,但是传统核转基因技术表达的dsRNA会进入植物细胞质,被植物自身的Dicer酶识别和剪切,导致ds RNA无法在细胞内稳定积累,难以被加工成有效的siRNA,影响了对靶标生物的RNAi效率和防控效果,导致转基因作物的抗虫效果不明显。以叶绿体基因组作为遗传操作平台的叶绿体(质体)基因工程技术克服了核转基因技术中的缺陷,拓宽了植物基因工程在防治病虫害领域的应用。

2.3 叶绿体转基因技术的应用

植物细胞中质体基因组的拷贝数可达1万,且缺乏RNAi机制,使得质体转基因技术成为表达 dsRNA的理想工具。近年来,相比于核转基因技术,叶绿体基因工程的优势逐渐显现,如减少了核转基因技术对植物生长发育的影响；在叶绿体中能稳定积累ds RNA以避免进入植物自身的RNAi系统等,这使得叶绿体转基因技术成为植物基因工程的一个新研究热点。目前,叶绿体介导的RNAi技术在防治植物病害方面的研究较少,但有一些基于叶绿体转基因技术表达抗菌蛋白,用于提高植物抗病性的研究。

3 利用VIGS策略防控病虫害

在农业领域,利用VIGS策略不仅能够改善农艺性状,还能防治病虫害,为作物提供保护。病毒是VIGS策略中的主要载体,由于病毒独特的侵染机制,能有效帮助dsRNA逃脱生物体的物理和生理屏障,在寄主体内实现dsRNA的高效递送。此外,利用微生物表达和递送dsRNA的方法也被归属于VIGS策略。例如,采用能产生dsRNA的大肠杆菌喂养昆虫,不仅可以避免dsRNA被昆虫消化系统中的酶降解,还能实现dsRNA的可持续供应。此外,利用共生菌产生害虫特异性的dsRNA,是一种无创伤递送dsRNA的方法,适用于多种靶标害虫。当靶标害虫摄入共生细菌后,细菌能在害虫体内持续增殖,保障充足的dsRNA,实现可持续的基因沉默。

4 利用SIGS策略防控病虫害

研究人员对喷洒型RNA农药防治农业病虫害进行了广泛的试验,证明SIGS是一种具有潜力的非转基因RNAi策略。SIGS策略比HIGS策略在病虫害防治中具有更广阔的应用前景。例如,喷洒型的RNA农药研发成本低,周期较短,应用场景多且无需面临严格的市场监管和登记审查。当dsRNA能够廉价、大规模地生产时,喷洒型RNA农药将是防治病虫害的理想药剂。

5 利用NDGS策略防控病虫害

5.1 创制喷洒型RNA农药的瓶颈

喷洒型RNA农药在植物表面能直接被昆虫或病原微生物吸收,诱导有害生物靶标基因的沉默。在实际生产应用中,喷洒型RNA农药受诸多环境因素限制。有研究报道,直接喷施的dsRNA暴露于空气中会被核酸酶和紫外线降解,而在自然环境中,雨水冲刷和气流变化会直接影响植物叶面dsRNA 的积累量,导致无法触发有效的RNAi反应。昆虫或病原微生物内部的核酸酶和pH环境都会影响dsRNA的稳定性,严重影响了RNA农药在有害生物体内的干扰效率。此外,昆虫的体壁和微生物的胞壁是阻碍dsRNA摄入的主要物理屏障,降低了喷洒型RNA农药的递送效率。例如,疫霉吸收dsRNA 的能力非常有限,炭疽菌则不能直接吸收dsRNA,而有益真菌绿色木霉吸收dsRNA的能力较弱。因此,研发纳米载体保护和递送dsRNA来克服喷洒型RNA农药应用瓶颈已成为前沿热点。

5.2 纳米载体对dsRNA的保护

由于dsRNA被植物吸收不是一个瞬时的过程,有延迟效应,喷洒型RNA农药在田间的应用效率与 dsRNA在环境中的稳定性密切相关。高效的RNAi依赖于充足的dsRNA,但实际应用中诸多因素会影响 dsRNA在植物表面的积累。基于纳米载体的递送策略能高效保护dsRNA,提升dsRNA在工作环境下的稳定性。纳米载体不仅能增加dsRNA在叶面的滞留量,减少因喷雾飘移而造成的损失,还能保护dsRNA 免受核酸酶降解和生物体内pH微环境的影响,提高dsRNA在生物体内的稳定性。有研究报道以生物黏土作为dsRNA的递送载体,发现其能够减少dsRNA因冲淋而产生的流失,提升了RNAi效率,延长了植物对病毒病的抗性周期。在另一项报道中,阳离子聚合物作为dsRNA的递送载体,在昆虫高碱性的肠道环境中为dsRNA提供了保护,提升了甜菜夜蛾的RNAi效率。

5.3 纳米载体对dsRNA的递送

基于纳米载体的递送策略还能有效促进dsRNA 在细胞内的扩散、摄取和内体逃逸,通过上调一些与摄取机制相关的基因,激活网格蛋白介导的内吞作用,提升dsRNA的递送效率。在细胞摄取纳米RNA复合物后,有些带胺基的纳米载体在细胞内酸性环境中会出现质子化效应,诱发溶酶体逃逸,释放dsRNA或siRNA进入细胞质,大幅度提升RNAi的递送效率。这种纳米载体还能穿透植物表皮屏障,将外源dsRNA送入植物体内,提升了dsRNA进入植物细胞的能力。

6 RNA农药应用实例

6.1 转基因植物介导RNAi的应用实例

基于转基因植物介导的RNAi技术在防治病虫害领域表现出巨大的应用潜力。在一些包含田间试验的科研型案例中,基于转基因植物介导的RNAi技术用于防治病虫害展现出良好的商业化前景。例如,在田间试验中,转基因棉花的叶片受损面积比正常植株减少了46%～53%,转基因棉花的单铃重量较正常植株增大了48%,有效减少了绿盲蝽对棉花产量和质量的损害。此外,在防治植物病害的应用方面, 由于转基因棉花表达真菌vdH1基因的dsRNA能够成功运输到真菌细胞中,并诱导病菌的基因沉默,阻碍了病原菌微菌核的形成,有效提高了转基因植株对大丽轮枝菌的抗性。拜耳、先正达等国际农药公司投入大量的人力和财力,并掀起了研发和商品化转基因植物的热潮。目前,拜耳公司在转基因玉米方面的研发已取得了显著成果,并基本投入商业化生产。

6.2 非转基因形式RNA农药的应用实例

目前,非转基因形式RNA农药在田间的有效性得到了越来越多的验证,但非转基因形式的RNA农药在田间应用案例较少,主要的障碍可能是生产dsRNA的成本高昂。ds RNA制剂易应用于甲虫类害虫。例如,在喷药初期,dsRNA药剂对害虫的防治效果为32%,不如化学药剂的防治效果,但在施药7d后,dsRNA制剂的防治效果与市售杀虫剂类似,达到了84%～95%。在田间喷洒RNA农药防治其他害虫,如鳞翅目和半翅目害虫的效果似乎不如甲虫类,部分原因在于甲虫类具有较少的降解酶且dsRNA不易被溶酶体消化,因而适合用于RNAi 。2019年,拜耳公司申请了喷洒型dsRNA用于防治蜜蜂狄斯瓦螨的产品登记。2022年,美国Greenlight Biosciences公司宣布申请登记了一种用于防治马铃薯甲虫的喷洒型dsRNA制剂。在防治植物病害方面,该公司宣布正在积极研发基于RNAi策略防治白粉病和灰霉病的喷雾型产品,预计于2025年获得批准上市。硅羿科技有限公司研发的烟草花叶病毒核酸干扰素目前已经完成登记测试,这种干扰素能够有效减少病毒病对烟草或其他茄科植物造成的经济损失。

7 展望

7.1 靶基因的筛选

靶基因筛选是影响RNAi效率的关键因素之一。理想的靶基因应该具备高致死和低剂量敏感等特点。若单个靶基因效果不好,可以2个或多个靶基因同时干扰,从而提升有害生物的死亡率。靶基因的筛选和挖掘是一项费时费力的工作,需要更多的研发投入。

7.2 低成本dsRNA的研发与工艺优化

基于RNAi技术防治病虫害的商业化案例有限,很大程度上受限于dsRNA的研发成本和复杂的工艺。目前,无论是在体内或体外合成dsRNA,主要是依赖噬菌体的T7序列和RNA聚合酶转录获得特异性序列。在植物基因工程中,培育表达靶标生物dsRNA的转基因植物耗时长、步骤复杂、效率低且成本高昂。在喷洒型RNA农药的研发中,如果采用商业化试剂盒合成所需的dsRNA,步骤虽然相对简单,但试剂成本高昂,生产规模小,且容易发生非特异性扩增导致dsRNA质量不佳。大肠杆菌或酵母表达体系是dsRNA低成本大批量合成的最常用工具。美国Greenlight Biosciences公司建立了以酿酒酵母发酵生产dsRNA的平台,通过在酵母中表达dsRNA用于害虫治理。该公司还开发了成本为0.5美元/g的dsRNA 产品用于抗病或杀虫,适合实际生产应用。此外,利用微生物产生特异性的dsRNA以诱导靶标生物的RNAi,在防治病虫害方面具有良好的应用前景。由于真菌、病毒或细菌的修饰相对容易,且能持续产生dsRNA,因而在基因递送和蛋白质表达方面都有应用。由于纳米材料载体对RNA制剂的高效保护和递送作用,低成本环保型纳米载体的需求无疑会越来越大。目前,我国科研界使用较多的星形阳离子聚合物纳米载体(SPc)的生产成本约为1.3美元/g,当大规模工业化生产后,能够进一步降低生产成本。

7.3 基于递送策略的安全性

目前,基于纳米载体、菌液或病毒的递送策略已被证实能有效提高ds RNA的递送效率并为其提供保护。其中,纳米材料作为递送载体的生物安全性一直备受关注,即纳米材料的降解问题、在环境中的扩散风险以及对非靶标生物的毒性。正常田间使用浓度无不良副作用,只有在极高浓度下,虽然不会影响异色瓢虫卵的孵化率,但会降低多种膜蛋白和溶酶体基因的表达量,损伤昆虫的肠道组织,导致幼虫死亡。另外,研究发现,只有极高浓度(1g/L)的SPc才会对果蝇的寿命、生育能力、攀爬能力以及抗逆性产生不利的影响,长期饲喂SPc则会积累在果蝇肠道组织中,并引起全身性变化。这些工作为评估纳米材料的生物安全性提供了方法和参考。另外,基于微生物系统的递送平台在环境中传播也可能会对人产生潜在的威胁。

7.4 基于4种策略的应用前景

7.4.1 HIGS策略

生物技术的快速发展使得培育抗虫或抗病转基因作物的方法越来越丰富,尤其是质体转基因技术在防治病虫害领域的应用。有研究报道,质体转基因技术通过表达多基因组元件,可同时赋予转基因植物对虫害、病害和非生物胁迫条件的抗性。虽然在一些单子叶植物中,由于缺乏叶片的再生体系,质体转基因技术无法利用多次再生培养和筛选来获得转化植株,但该技术符合植物基因工程未来的发展方向,即安全、稳定和高效地表达有害生物的靶标基因ds RNA,因而将广泛地应用于农业领域。

7.4.2 VIGS策略

在农业病虫害治理方面,以病毒或微生物作为 dsRNA的载体用于触发靶标生物RNAi的策略具有应用潜力。未来,将病毒或微生物作为dsRNA的高效递送载体,还需要开发导入产生特异性dsRNA所需模板的有效方法,为大规模创制施用药剂奠定基础。另外,病毒或微生物在田间大规模施用之前,亟需解决的是在环境中释放病毒或微生物所引起的潜在问题。

7.4.3 SIGS策略

近年来,喷洒型RNA农药在病虫害防治领域取得了长足的进展,具有广阔的应用前景。例如,研发喷洒型RNA农药所需的时间比培育转基因植物短,喷洒型RNA农药能够相对快速地应对新环境和新入侵的病虫害,从而实现病虫害的应急管理。虽然,喷洒型RNA农药在田间大规模应用之前还需要克服诸多瓶颈限制,但目前已有基于载体或其他保护剂的递送系统用于提升dsRNA的稳定性和递送效率,从而实现喷洒型RNA农药对病虫害的高效治理。

7.4.4 NDGS策略

利用纳米载体来保护和递送RNA农药快速进入植物和害虫体内无疑具备广阔的发展前景。此外,可通过研发多元化的RNA制剂解决RNA农药田间防效不理想的困境。纳米载体通过内部的疏水结构结合苦参碱,同时借助外部基团的电荷作用及氢键作用进一步结合dsRNA,通过RNAi引起桃蚜细菌性感染,防效可提升至90%,与化学农药的防效相当。这种利用纳米载体同时装载dsRNA和药剂的新思路可以治理害虫的抗药性、大幅度提升害虫的防治效果。干扰蚜虫对噻虫嗪应急响应基因synapsin之后,半数致死剂量条件下的噻虫嗪对蚜虫的致死率上升至100%,低剂量噻虫嗪对蚜虫的致死率也能达到90%。未来,还应该进一步设计智能响应型纳米载体(机器人),实现多功能、精准靶向和可控递送,不断提升RNA农药的田间效果,使其接近或达到化学农药的防治效果。

作者：关梅,晁子健,闫硕,沈杰

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